外泌體作為腫瘤微環境的主要成員，是一種直徑為30-150nm的雙膜囊泡，內含mRNAs、microRNAs、DNAs、蛋白質和脂質等重要信息，是細胞間通訊的重要方式。
外泌體具備的特殊結構和功能，一方面可作為疾病分子診斷的指標，另一方面也可作為藥物的天然載體用於臨床治療，具有巨大的應用價值。
近年來，隨著外泌體提取技術的成熟，越來越多的研究者將目光投向了外泌體。外泌體研究有哪些方向呢?
別人都是怎麼開展的呢？
現小編分享一篇關於肝癌細胞外泌體的文章，是長弓生化科技首席科學家張弓教授團隊，也是長弓生化科技的高級技術支持盧少華博士於2017年7月份發表在proteomics期刊上的科研成果，由於該科研成果在外泌體專業領域中具有一定的代表性，因此還被評選為雜誌封面文章呢，現在就讓我們一起來學習一下吧！
「研究摘要」
文章作者提出了肝癌細胞所分泌的外泌體其蛋白質組的特點與癌細胞的運動性有關的假說。
因 此，作者通過採用了質譜super-SILAC定量蛋白質組學方法比較了三株不同運動能力的肝癌細胞（一株非運動型細胞Hep3B以及兩株運動型 MHCC97H和MHCCLM3細胞）的外泌體蛋白質組，分析結果發現運動型肝癌細胞與非運動型肝癌細胞的外泌體其差異蛋白質主要聚焦在糖代謝中心途徑 上，比如糖酵解途徑I，糖異生途徑I和磷酸戊糖途徑，這個分析結果符合了基因本體論中的底層生物學進程的強化特點。
最後，文章得出的結論是：相比於非運動型的肝癌細胞，運動型的肝癌細胞更加傾向於通過外泌體主動優先運輸糖代謝相關蛋白。
「研究方法」
文章作者收集了3株肝癌細胞的培養液上清，通過超速離心和ExoQuick方法富集了外泌體（圖一）。並且對富集出來的外泌體進行了透視電鏡和NanoSight分析，以及對外泌體蛋白進行質譜super-SILAC定量蛋白質組和差異蛋白分析。
「實驗結果」
文章首先對三株肝癌細胞的運動表型進行確認，Western Blot 實驗結果顯示：Hep3B相比於惡性程度更高
的97H和LM3細胞，E-cadherin含量較高，Slug含量少，這與其非運動性的表型是一致的（圖二）。
進而透視電鏡和NanoSight分析結果都顯示了外泌體是大小為30-150nm的雙膜小囊泡（圖三）。
在檢測外泌體標記蛋白時發現， Hep3B細胞相比於97H和LM3細胞，其外泌體標記蛋白ALIX，HSP90以
及CD9表達含量都比較低，甚至在Hep3B中檢測不到CD9蛋白（圖四）。
文 章接著使用了spuer-SILAC方法，打了質譜（圖五），做了兩次生物學重複。質譜鑑定到的外泌體蛋白分別是1495/Hep3B、1409 /97H、1424/LM3，並且兩次生物學重複的相關性良好，累計曲線表明86%的蛋白都在50%生物學重複變異度範圍內（圖六）。
基於質譜定量的分析結果，文章以1.5倍的差異倍數篩選差異蛋白（DEPs）。結果發現97H/Hep3B組：197個（26%）上調，272（37.3%）下調。LM3/Hep3B組：245個（34.9%）上調，245個（34.9%）下調。對這些差異蛋白分別進行IPA通路分析和GO富集分析，結果表明DEPs顯著富集在糖代謝相關通路（圖七）。
文章還對一部分差異蛋白質進行了Western Blot驗證，驗證結果與質譜定量分析結果一致，再次表明質譜鑑定的可靠度（圖八）。
文 章最後，還結合了該科研團隊前期的多組學數據，包括了：三株肝癌細胞的轉錄組、翻譯組和蛋白質組數據進行綜合分析，發現三株肝癌細胞的外泌體蛋白質組的特 徵與其細胞的蛋白質組和翻譯組特徵相一致（圖九），且多組學數據的交集蛋白其上調差異蛋白顯著富集在糖代謝相關通路上（圖十），再次說明了不同運動型的肝癌細胞其差異蛋白質和其所分泌的外泌體差異蛋白質均表現出了一致的生物學功能。
張弓教授團隊的這篇文章通過對不同運動型的肝癌細胞外泌體蛋白質組進行系統的定量分析，發現運動型的肝癌細胞更傾向於主動包裹糖代謝相關的功能蛋白質至外泌體中，並且通過外泌體將這些功能蛋白質釋放到周圍的腫瘤微環境中。這些外泌體蛋白質具有非常緊密的相互作用功能網絡，主要集中在糖酵解途徑I、糖異生途徑I和磷酸戊糖途徑。最後，這三株肝癌細胞的外泌體蛋白質組特性能夠反映其相對應的細胞蛋白質組和翻譯組的特性，還可以用於區分運動型和非運動型的肝癌細胞呢！
以上就是這篇文獻的研究內容了。是不是躍躍欲試了？趕快動手設計自己的外泌體研究實驗吧~
長弓生化科技一直專注科研領域最新進展，旨在為廣大科研工作者提供優質技術服務，首席科學家張弓教授坐鎮方案設計和分析流程。您在實驗設計或者樣品準備階段有任何疑問，歡迎隨時與我們聯繫!
參考文獻：
Mo le†hepatocellular†carcinoma†cells†preferen ally†secret†sugar†metabolism†regulatory†proteins†via†exosomes. Proteomics†17¨†13–14¨2017.
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